Resiquimod-R848

    Resiquimod是一种Toll样受体7和8 (TLR7/TLR8) 的激动剂， 诱导细胞因子如TNF-α，IL-6和IFN-α的上调。

 

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    生物活性

 

    体外

 

    瑞西莫德（R-848）诱导半抗原和过敏原特异性循环T细胞（包括TH2效应子）产生IFN-γ，甚至丧失产生IL-4的能力。Resiquimod（R848）以剂量依赖性方式增强PBL增殖，并在BrdU掺入试验中增加BrdU阳性细胞的数量。用R848处理的细胞表现出显着增加的（3.5倍）萤光素酶（NF-κB活性的报告基因）活性。

 

    体内

 

    Resiquimod（R-848）（50μg/只，即时途径）显着上调SPF中IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IL-1β，IL-4，iNOS和MHC-II基因的表达鸡。

 

    实验参考方法

 

    激酶测定

 

    对于萤光素酶测定，用萤火虫NF-κB特异性萤光素酶报道载体pNFκB-Met-Luc2转染FG-9307细胞。通过与pSEAP2对照载体共转染来监控转染效率，该载体可组成型表达人类分泌的增强型碱性磷酸酶（SEAP）。然后将细胞用Resiquimod（R848，1 ?g / mL），CQ（10 ?M），CQ加R848或PBS处理，并在22°C孵育24小时。然后分别使用萤光素酶测定试剂盒和Great EscAPe?SEAP化学发光检测试剂盒分析转染子的培养基的萤光素酶活性和SEAP活性。该测定进行三次。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    细胞分析

 

    为了抑制溶酶体酸化，将细胞与10 ?M CQ一起温育1小时，然后再使用Resiquimod（R848）处理。处理后，将20 ?L 5 mg / mL MTT加到平板中。将该板在22℃下孵育4小时，然后向该板中加入200μL二甲基亚砜以溶解还原的甲maz。然后用酶标仪在490 nm处读数。为了确定Myd88抑制对R848诱导的细胞增殖的影响，将Myd88抑制剂Pepinh-MYD和对照肽Pepinh-Control加入到PBL中，浓度为50 ?M，并将板在22°C孵育6小时。 。孵育后，将细胞用R848处理，并如上所述进行MTT测定。为了确定NF-κB失活对R848诱导的细胞增殖的影响，BAY-11-7082是一种不可逆的IκB-α磷酸化抑制剂，将其以1μM的浓度添加到细胞中，并将板在22℃下孵育1小时。温育后，将细胞用R848处理并如前所述进行MTT测定。所有实验进行三次。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    Animal Administration

 

    将总共??40只两周大的SPF鸡分配到以下四个实验组之一（n = 10 /组）中。B组：灭活的NDV疫苗；C组：由慢病毒菌株制备的商业油佐剂灭活的NDV疫苗，D组：灭活的NDV疫苗和R-848的组合（50μg/只鸟）。在大腿肌肉中通过肌内途径施用疫苗或PBS。免疫后14天给予增强剂量（dpi）。升压后两周，实验性SPF鸡受到NDV的速溶毒株攻击（10 5  ELD 50每只鸟）。每天观察到攻击后（dpc）直至14天的临床体征和死亡率。在攻击后的第0、4、7和14天从家禽中收集泄殖腔拭子（n = 6 /组），并通过腹腔内途径接种到10天大的有胚鸡蛋中（n = 3个鸡蛋/样本）。接种后三天，使用10％鸡RBC通过点血凝集检查尿囊液中NDV的生长。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。