Phorbol 12-myristate 13-acetate

    Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 是一种佛波酯，是蛋白激酶 C (PKC) 和 SphK 的激活剂。

 

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    生物活性

 

    体外

 

    为了检查PKC在p38MAPK磷酸化中的作用，用PKC激活物PMA（100 nM）刺激细胞，该激活物模拟PKC的天然激活物DAG与PKCs C1区的结合。在两种细胞类型中，与GnRH在αT3-1细胞中观察到的相似，通过PMA观察到p38MAPK磷酸化，即缓慢的持续活化（分别在30分钟时分别为3.2倍和3.6倍）。由GnRH和PMA激活的PKC在p38MAPK磷酸化中起不同作用的矛盾发现可能由PKC的不同定位所解释。通过电压门控性Ca 2+通道和Ca 2+通过Ca 2+内流介导αT3-1细胞中p38MAPK磷酸化的基础，GnRH和PMA刺激动员，而在分化的LβT2促性腺激素细胞中，它仅由Ca 2+动员介导

 

    体内

 

    PMA是PKC激动剂，可逆转5-羟基癸酸（5-HD）引起的损伤。因此，通过PKC途径激活mitoKATP保护了SOD和MDA中的线粒体功能

 

    实验参考方法

 

    细胞分析

 

    αT3-1和LβT-2细胞在5％CO 2潮湿培养箱中的DMEM中单层培养在37°C下。在相同培养基中用0.1％FCS进行血清饥饿16小时。然后按照指示的时间长度添加GnRH和PMA。通常，通过ExGen 500或jetPRIME瞬时转染αT3-1细胞，而仅通过jetPRIME转染试剂瞬时转染LβT2细胞。对于使用显性阴性（DN）PKC的实验，将αT3-1细胞（在6 cm平板中）用1.5μgp38α-GFP，3μg对照载体，pCDNA3或3μgDN-PKCs构建体转染。对于LβT2细胞，用4μgp38α-GFP和9μg对照载体pCDNA3或9μgDN-PKCs构建体进行转染（在10 cm平板中）。转染后约30小时，将细胞血清饥饿（0.1％FCS）处理16小时，然后用GnRH或PMA刺激，用冰冷的PBS洗涤两次，用裂解缓冲液处理，随后进行一个冻融循环。收获细胞；离心（15,000×g，15分钟，4°C）后，将上清液用于免疫沉淀实验

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    动物管理局

 

    大鼠

 

    所有实验均对雄性Wistar大鼠（体重250-280g）进行。135只Wistar大鼠随机分为7组。（1）假手术组（n = 21）的大鼠侧脑室注射0.9％的生理盐水；（2）IR组（n ＝ 21）在大脑中动脉闭塞（MCAO）前30分钟给予侧脑室注射0.9％生理盐水。（3）在MCAO前30分钟，给羧甲基环己酮（CBX）组（n = 21）的大鼠脑侧面注射CBX（5μg/ mL×10μL）；（4）在MCAO前30分钟，对Sch-6783组（n = 21）的大鼠进行侧脑室注射DZX（2 mM×30μL）；（5）对5-HD组（n = 21）的大鼠进行脑侧脑室注射5-HD（100mM×10μL），在10分钟后，在MCAO之前15分钟注射DZX；（6）DZX + Ro组（n = 15）的大鼠脑室侧面注射DZX，10分钟后，在MCAO前15分钟注射Ro-31-8425（400μg/ kg）；（7）5-HD + PMA组（n = 15）的大鼠在注射5-HD和DZX后进行腹膜内注射PMA（200μg/ kg）。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。