Y-27632 dihydrochloride
2019-06-17 
MCE小分子
Y-27632 dihydrochloride 是 ATP 竞争性的 ROCK-I 和 ROCK-II 抑制剂，Ki 分别为 220 nM 和 300 nM。
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体外
Y-27632抑制ROCK家族的激酶比其他激酶（包括蛋白激酶C，cAMP依赖性激酶和肌球蛋白轻链激酶）强100倍。Y-27632延长滞后时间并以浓度依赖性方式延迟BrdU标记细胞的出现，在分别用10和100μMY-27632处理的Swiss 3T3细胞中观察到约1和4小时的延迟。Y-27632促进脂肪组织来源的干细胞（ADSCs）的神经元分化。与1.0和2.5μMY-27632诱导组相比，神经样细胞的百分比在5.0μMY-27632诱导组中达到峰值。
体内
与盐水组相比，Y-27632（5和10 mg / kg）显着延长肌阵挛性抽搐的起效时间。与生理盐水组相比，Y-27632（5和10 mg / kg）显着延长阵挛性惊厥的发作时间[3]。与对照动物（SS组）相比，用二甲基亚硝胺（DMN）治疗导致大鼠体重和肝脏重量（DMN-S组）显着降低。口服Y27632（30 mg / kg）基本上可以防止这种DMN诱导的大鼠体重和肝脏重量减轻（DMN-Y组）。
实验参考方法
激酶测定
通过使用Lipofectamine转染，重组ROCK-1，ROCK-II，PKN或citron激酶在HeLa细胞中表达为Myc标记的蛋白，并通过使用与G蛋白偶联的9E10单克隆抗Myc抗体从细胞裂解物中沉淀。-琼脂糖。回收的免疫复合物与不同浓度的[ 32 P] ATP和10 mg组蛋白2型作为底物在不存在或存在各种浓度的Y-27632或Y-30141的情况下在30°C下以总体积培养30分钟的含有50mM的HEPES-NaOH，pH 7.4中，10毫摩尔MgCl的激酶缓冲液的30μL 2，5mM的的MnCl 2，0.02％Briji 35，和2mM二硫苏糖醇。将PKCa与5μM孵育[32P] ATP和200μg/ mL组蛋白2型作为底物，在不含或存在各种浓度的Y-27632或Y-30141的情况下，在含有50 mM Tris-HCl，pH 7.5的激酶缓冲液中于30°C保持10分钟，0.5mM CaCl 2,5mM乙酸镁，25μg/ mL磷脂酰丝氨酸，50ng / mL 12-O-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯和0.001％亮抑酶肽，总体积为30μL。通过添加10μL的43 Laemmli样品缓冲液终止孵育。煮沸5分钟后，将混合物在16％凝胶上进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。用考马斯亮蓝染色凝胶，然后干燥。切除对应于组蛋白2型的条带，并测量放射性
MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
细胞分析
HeLa细胞以每3.5cm培养皿3×10 4个细胞的密度接种。在10mM胸苷存在下，将细胞在含有10％FBS的DMEM中培养16小时。用含有10％FBS的DMEM洗涤细胞后，再培养8小时，然后加入40ng / mL的诺考达唑。在Nocodazole处理11.5小时后，加入各种浓度的Y-27632（0-300μM），Y-30141或载体，并将细胞再孵育30分钟。
MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
Animal Administration
小鼠
使用体重25-30g的雄性近交瑞士白化小鼠（2-3个月大）。每周给小鼠注射亚痉挛剂量的PTZ（35mg / kg，ip）（周一，周三和周五），共注射11次。在每次PTZ注射后，观察小鼠30分钟并记录惊厥活动的发生。30分钟后，然后给小鼠注射法舒地尔（25mg / kg，ip）或Y-27632（5mg / kg，ip）并返回其家笼，直至下一次注射。用于法舒地尔和Y-27632的对照小鼠接受盐水。
大鼠
雄性Wistar种A使用大鼠（200-250g）。将DMN（1μg/ mL）用盐水（终浓度1％）稀释10倍，并且在每周的前3天腹膜内（ip）注射10mg / kg每天的DMN，持续4周。从第一次注射DMN开始，每天以30mg / kg的剂量口服给予Y27632，持续4周。30mg / kg的剂量在几种大鼠模型中校正高血压而没有毒性。将20只大鼠随机分成4个实验组（每组n = 5），如下：（1）SS（腹腔注射生理盐水和口服生理盐水）; （2）SY（腹腔注射生理盐水和口服Y27632）; （3）DMN-S（DMN ip和口服盐水）;（4）DMN-Y（DMN ip和口服Y27632）。每周称重大鼠。在第四周结束时将它们处死并切除肝脏。另外，在处死大鼠之前立即采集血样。
MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
