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怎么选择磁珠和琼脂糖珠

  蛋白纯化似乎是生物学“研究僧”们躲不过的一个“劫”,很多童鞋开始就难住了,微珠怎么选?选哪一种?小朋友你是否也有很多问号?不用担心,萌 Cece 为您解惑!
  长久以来,多孔的琼脂糖珠 (也称琼脂糖树脂) 作为免疫沉淀实验中的固相支持物常用的材料。
 
  琼脂糖珠海绵状的结构 (直径 50-150 μm) 可以结合抗体 (继而结合靶蛋白),它能够直接高效、快速结合抗体,而不需借助特殊的专业设备。
琼脂糖珠
  图 1. 琼脂糖珠
 
  在无需抗体饱和的情况下,琼脂糖珠能很好的结合极大量目的蛋白。但值得注意的是,在免疫沉淀实验中,抗体的量常常不足以满足琼脂糖珠的饱和荷载量,没有被抗体覆盖的琼脂糖珠的部分则可以自由地结合任何可粘附的物质,这种非特异性结合升高引起背景信号升高,这时,“高荷载量优势”会变成“高荷载量劣势”。对裂解样本进行预处理操作,是去除非特异性结合物最为简单有效的方法。
 
  ■ 预处理
 
  裂解样本是蛋白质、脂质、碳水化合物和核酸的混合物,与抗体、蛋白 A/G、微珠材料会发生非特异性结合,从而对免疫沉淀结果造成影响。主要方法有两种:
 
  a. 排除由于微珠本身材质引起的非特异性结合:将裂解样本与微珠单独混合孵育,随后去除微珠并收集上清液,再进行免疫沉淀实验。
 
  b. 排除由细胞成分引起的非特异性结合:使用相同抗体亚型类别但不靶向目的蛋白的抗体,在相同的组分条件中与裂解样本混合孵育,再进行免疫沉淀实验。
  目前,超顺磁性微珠已经大幅取代琼脂糖珠,成为免疫沉淀和其他微量亲和纯化方法的首先选择。
 
  与琼脂糖珠不同,磁珠是固体,抗体的结合仅限于磁珠的表面。磁珠 (直径 1-4 μm) 明显小于琼脂糖珠,尽管磁珠没有多孔中心增加结合能力,但每体积的磁珠数量比琼脂糖珠多,使磁珠拥有足够的抗体结合表面积满足高容量的抗体结合。
磁珠
  图 2. 磁珠
 
  ■ 结合能力
 
  由于琼脂糖珠直径较大且具有海绵状结构,因而比磁珠有更大的表面积和更大的结合能力。但是琼脂糖珠的可变多孔径会使抗体会落入孔内,导致结合受限,尤其是超大蛋白 (一般是蛋白复合物) 的结合,并且抗体可能会在洗涤步骤 (离心) 中流失。相反,绑定在磁珠表面的抗体均能与目的蛋白结合,并且抗体很少会在温和的洗涤步骤 (磁性分离) 中流失。
 
  另外,琼脂糖珠的非特异性结合能力大于磁珠。琼脂糖珠的非特异性结合不限于其表面抗体结合位点,抗体的任何表面或参加免疫沉淀反应的成分均可与样品中非目的蛋白成分结合,即使使用完全饱和的珠子,仍会发生非特异性结合。因此,进行免疫沉淀之前预处理样品极为重要。
 
  ■ 成本
 
  免疫沉淀中设计微珠的成本主要取决于免疫沉淀方法和每个免疫沉淀反应所需要的微珠量。
 
  琼脂糖珠:琼脂糖珠必须通过离心浓缩在管底部,并在每次孵育和洗涤除去上清液,通常需要肉眼识别管底部的琼脂糖珠,因此,每个免疫沉淀实验至少需要使用 25-50 μL 的琼脂糖珠。
 
  磁珠:采用磁性分离,无需设定最小体积的的磁珠使用量,用量仅取决于目的蛋白和免疫沉淀抗体。
 
  当然,在使用琼脂糖珠的过程中,可以使用过滤离心柱代替普通的微量离心管,该离心柱包含一个过滤器,允许通过短暂的离心使除珠子外的所有免疫沉淀成分流过,因此可以显著减少每个反应所需的琼脂糖珠使用量。
 
  ■ 简单快速
 
  由于琼脂糖珠免疫沉淀需要较长的孵育时间,预处理步骤和多次离心,所以其需要大量的手动操作,总时间为 1-1.5 小时。相反,磁珠免疫沉淀反应不需要离心,配合使用磁性分离架磁性分离,在 30 分钟内即可完成实验,因此可以在较短时间内轻松处理并获得较多样本的分析数据。
 
  ■ 自动化
 
  磁珠操作简便,因此可以使用自动化免疫沉淀设备,不仅节省了工作量和时间,还可以应用于高通量。
 
  当样品体积< 2 mL,建议使用磁珠。在日常小型分离特定蛋白质和蛋白复合物时,以及进行手动和自动化标准 IP、Co-IP、ChIP、ChIP-Seq、RIP 和 Pull-down 反应并立即用于后续检测分析时,磁珠是最佳选择。
 
  当样品体积> 2 mL,建议使用琼脂糖珠。当抗体成本较低并且想要纯化大量目的蛋白用于多种下游分析时,琼脂糖珠是最佳选择。

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