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Forskolin的作用

  Forskolin 是一种有效的 腺苷酸环化酶 激活剂,结合到 I 型腺苷酸环化酶 IC50 为 41 nM,激活 I 型腺苷酸环化酶 EC50 为 0.5 μM。

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  Forskolin的生物活性研究

  体外

  Forskolin(Fsk)是一种从Coleus forskholii中分离的天然二萜,通过其催化亚基直接激活腺苷酸环化酶(AC),以增加环腺苷一磷酸(cAMP)的细胞内水平[1]。 Forskolin(Fsk)影响人T细胞系的增殖,例如Kit 225和MT-2。 Forskolin处理以剂量依赖性方式抑制Kit 225和MT-2细胞的增殖,IC 50等于~5μMFsk。 Forskolin处理(10-100μM)使cAMPi水平增加?基础水平的5至20倍,达到50-100μMForskolin之间的最大水平。

  体内

  Forskolin(Fsk)治疗的Mrp4 - / - 小鼠显示Ki67阳性和切割的半胱天冬酶3阳性EC数量增加,周细胞覆盖量显着减少,空袖数量减少。 在暴露于从P7到P12的高氧(75%氧)的幼鼠中,Mrp4 - / - 小鼠显示未血管化的视网膜区域显着增加。 健康大鼠组的平均血糖为102.12±1.94 mg / dL,对照组为101.25±3.56,毛喉素组为103±2.08。 数据显示,研究结束时葡萄糖水平在毛喉素组中较低,根据应用的统计学检验有显着差异(p = 0.03)。

  Forskolin的溶剂和溶解度

  体外:

  DMSO:≥32mg / mL(77.95 mM)

  *“≥”表示可溶,但饱和度未知。
forskolin的溶解度

  *请参阅溶解度信息以选择合适的溶剂。

  Forskolin的实验参考方法

  激酶测定

  对于Jak3激酶测定,将Fsk处理的MT-2细胞裂解,澄清,并使用Jak3抗体进行免疫沉淀。 激酶反应在30℃下进行20分钟。 对于PKA激酶测定,裂解未处理的MT-2细胞,并将Jak3免疫沉淀并与PAS珠结合。 免疫沉淀的Jak3用激酶缓冲液(50mM Hepes-NaOH(pH 7.4),10mM MgCl 2,0.5mM EGTA,0.5mM DTT,20μg/ mL抑肽酶,10μg/ mL亮肽素,1μg/ mL胃蛋白酶抑制剂A)洗涤。 与200μMATP和纯化的蛋白激酶A催化亚基(PKAc)一起温育,如图例中所示。 激酶反应在32℃下进行30分钟,然后用冷激酶洗涤缓冲液剧烈洗涤珠子。 对于使用重组Jak3的[γ-32P] ATP放射性标记的激酶测定,根据制造商的说明,使用Lipofectamine 2000,用野生型(WT)Jak3或激酶死亡的Jak3K855A转染Hek293细胞。 裂解细胞并用Jak3抗体免疫沉淀。 将Jak3结合的PAS珠在冷裂解缓冲液中洗涤三次,然后用激酶缓冲液洗涤。 通过向Jak3结合的PAS珠反应混合物中添加10μCi[γ-32P] ATP,10μM未标记的ATP和1μg纯化的PKAc来启动激酶反应。 激酶反应在32℃下进行30分钟。 将Jak3结合的PAS珠子在放射免疫测定缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 7.4,75mM NaCl,20mM EDTA,10mM EGTA,20mM Na 4 P 2 O 7,50mM NaF,20mM 2-甘油磷酸盐,1mM)中洗涤三次。 对硝基苯磷酸盐,0.1%Triton X-100)和一次在激酶洗涤缓冲液中。 通过加入2×SDS-PAGE样品缓冲液然后SDS-PAGE终止反应。 从PVDF膜上切下考马斯可染色的Jak3条带并进行磷酸氨基酸分析。

  MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。

  细胞分析

  将静止试剂盒225或MT-2细胞以每孔5×10 4个细胞接种到96孔板中。 然后用1%DMSO(载体)或毛喉素在1,5,10,25,50和100μM浓度下预处理细胞1小时。 用IL-2刺激细胞并在37℃下再培养20小时。 对照细胞用1%DMSO处理20小时。 在最后4小时的孵育期间,用[3H]胸苷以0.5μCi/200μL的浓度脉冲细胞。 将细胞收获到玻璃纤维滤器上并使用液体闪烁计数进行分析

  MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。

  Animal Administration

  小鼠

  使用C57BL / 6J小鼠。 Mrp4敲除小鼠,建立并反复与C57BL / 6J小鼠回交。 在出生后第4天(P4)和第5天(P5)将毛喉素腹膜内注射入新生小鼠。 注射DMSO的小鼠作为对照。 处理的小鼠在P6处安乐死,并且分离它们的视网膜用于整装免疫组织化学(IHC)。 首先测试不同浓度的毛喉素对存活率和视网膜脉管系统的影响,确定最佳浓度,P4时为1.0μg/50μL(0.3 mg / kg),1.5μg/50μL(0.5 mg / kg) 在P5,用于比较WT小鼠和Mrp4缺陷小鼠之间的视网膜血管表型。

  大鼠

  雄性Wistar大鼠,年龄10-14周龄,平均体重300g±50g,分为四组; 19实验诱导发展为糖尿病,8保持健康状态。 糖尿病和健康大鼠均不接受Forskolin(对照),或每天6mg / kg的Forskolin,口服给药8周。 在毛喉素治疗之前和之后,在每组中测定血糖水平。 在确认存在糖尿病(诱导后三周)和指定治疗八周后两周测试糖尿病大鼠。

  MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。

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