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IWP-2是WNT抑制剂

    IWP-2 是 Wnt 加工和分泌的抑制剂,其 IC50为27 nM。IWP-2 靶向膜结合的 O-酰基转移酶porcupine (Porcn),从而阻止关键的 Wnt 配体棕榈糖基化。
 
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    生物活性
 
    体外
 
    IWP-2,WNT加工和分泌的抑制剂。IWP-2可显着增强LEF的抗增殖作用。同样明显的是,与单一药物相比,LEF和IWP-2的结合可以最大程度地降低β-catenin,c-Myc,Cyclin D1,Bcl2和Bax的表达
 
    在MKN28细胞系中处理4天后,10-50μMIWP-2显着抑制了MKN28细胞的增殖(P <0.05)。另外,IWP-2处理后,依赖于锚和不依赖于锚的菌落数显着减少(P <0.05)
 
    体内
 
    为了评估IWP-2的体内功效,在注射类似体积的充有蓝色染料的乳胶珠之前约2 h,分别将200μLIWP-2-脂质体或游离脂质体分别腹膜内注射到C57BL / 6小鼠中或大肠杆菌DH5α。通过CFU在2 h内腹腔灌洗细胞中评估,IWP-2导致蓝珠和大肠杆菌的摄取显着降低。另外,与对照值相比,相应小鼠的灌洗液中TNF-α和IL-6的水平降低了2-4倍。有趣的是,IWP-2甚至诱导抗炎细胞因子IL-10的分泌大量增加。
 
    实验参考方法
 
    细胞分析
 
    将人RCC细胞系786O和Caki-2(5×10 3)接种到96孔板中。将Caki-2单细胞与浓度递增的LEF和20μMIWP-2一起孵育48小时后,通过MST分析评估细胞活力。处理后,将10μLMTS加入每个孔中进行2小时孵育。使用型号ELX800微孔板读数器在490 nm下测量吸光度。对于集落形成分析,将Caki-2细胞胰蛋白酶消化为单细胞悬液,并以1000个细胞/孔的密度接种到新鲜的6孔板中。然后将细胞与所示浓度的LEF孵育7天。用无水甲醇将菌落固定15分钟,然后用0.1%结晶紫染色20分钟。用PBS洗涤3次后,用数码相机观察直径超过2 mm的菌落.
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
 
    动物管理局
 
    小鼠
 
    大约3个月大的C57BL / 6小鼠在12小时的明暗循环中于23°C笼中饲养四到五只。首先给小鼠腹膜内(ip)注射200μL脂质体-IWP2(LI)或脂质体(L),然后2小时后,在200μL无菌PBS 中用1×10 8或2×10 8 CFU大肠杆菌注射。2小时或24小时后,处死小鼠,并用5 mL无菌冰冷PBS洗涤腹膜腔。将腹膜灌洗液以300x g离心5分钟,将细胞沉淀重悬于RPMI 1640完全培养基中,并将上清液用于细胞因子测定。对于离体实验,按上述方法从正常小鼠中分离出腹膜吞噬细胞,并将等量的细胞在37°C的5%CO 2中接种于培养基中过夜在进行进一步的实验之前。
 
    大鼠
 
    使用重220-280g的成年,雄性和健康的Wistar大鼠。将大鼠随机分为6组,每组如下(n = 72,每组12只):(1)假组(S组),(2)I / R组(I / R组),(3)I / R + DMSO组(DMSO组),(4)I / R + IWP组(IWP组),(5)SP组(SP组)和(6)SP + Wnt抑制剂IWP-2组(SP + IWP组)。在S组中将心脏连续灌注120分钟。平衡10分钟后,将离体的心脏连续进行20分钟灌注,然后进行30分钟局部缺血,然后在I / R组中进行60分钟再灌注。DMSO,IWP,SP和SP + IWP组接受含有0.5 mL / L DMSO,10 ?M IWP(美国SIGMA-ALDRICH),2.4体积%七氟醚,2.4体积%七氟醚+10 ?M IWP的KH溶液灌注15分钟,分别在I / R之前冲洗5分钟。
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

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