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Western Blot的实验操作方法

  “我明明按照操作步骤来,为什么就是跑不出?”“为什么我的 WB 总是跑得不干净?”“日常羡慕文献里漂亮的 WB 结果”,小小 Western Blot 难倒一片科研党,又泡了一年实验室的萌 Cece 已略有经验~~好东西当然要分享啊~~
 
  元气满满的一天,相信今天一定会跑出漂亮的条带。我的小幸福就是看到目的蛋白的那一刻!
 
  看我一顿操作猛如虎
 
  电泳 → 转膜 → 封闭 → 孵一抗 → 孵二抗 → 检测,剩下的就是等待。
 
  
  图 1. Western blot 操作流程简介
 
  理想很丰满,现实很骨感,像在某宝买东西写差评:跟想象中不一样。顺便再晒几张“辣眼”买家秀以证现实的残酷。我的实验结果中出现了各种稀奇古怪的玩意儿???
 
  ■ 古怪一:高背景
 
  
 
  萌 Cece 分析:
 
  1、洗涤不充分,膜没有洗干净。
 
  2、封闭不充分,一抗可能直接结合到膜上,造成二抗孵育时在非特异性位点发生结合。
 
  3、一抗/二抗浓度太高,出现非特异性结合。
 
  措施:
 
  1、对于洗涤不充分,可适当增加洗涤次数和时间,也可尝试提高洗涤液中 Tween-20 的含量 (如提高至 0.5-1%) 。
 
  2、要解决封闭不充分这个问题,可尝试延长封闭时间,也可更换封闭液。常用的封闭剂有 5% 脱脂奶粉、5% BSA、血清和明胶等,推荐室温封闭 1 小时以减少背景。另外,脱脂奶粉常含有酪蛋白,由于酪蛋白会结合磷酸化抗体而易产生高背景。因此,检测磷酸化蛋白时建议用 BSA 作为封闭剂。
 
  3、如果一抗/二抗浓度太高,出现非特异性结合,洗涤也无法完全去除,建议设置多个抗体稀释梯度,从而筛选出合适的抗体比例。
 
  ■ 古怪二:斑点
 
  
 
  萌 Cece 分析:
 
  封闭液中出现了不溶性物质。
 
  措施:
 
  建议将封闭液充分溶解后进行过滤。
 
  ■ 古怪三:最头疼的,没有按照预期结果出现令人满意的条带,如:加入 p38 抑制剂,但 p-p38 表达量没有变化。
 
  
 
  萌 Cece 分析:
 
  p38 虽然在不同的细胞中广泛表达,但是在没有诱导的情况下,表达量很低。
 
  措施:
 
  为了成功检测到 p38 的表达,建议:
 
  1、使用阳性对照确保实验体系没有问题。
 
  2、根据实验设计与需求使用诱导物 (如 LPS) 提高表达量。
 
  
  图 2. LPS 处理前后 p38 表达量对比
 
  SB202190 是一种选择性的 p38 MAPK 抑制剂。SB202190 与 p38 激酶的 ATP 袋结合。
 
  
  图 3. 在 LPS 诱导的情况下, SB202190 抑制 p38 磷酸化水平
 
  SB203580 是一种 p38 MAPK 的选择性抑制剂。SB203580 抑制 p38 活性时,只抑制了由诱导剂 (如 LPS) 引起的 p-p38 增加量,但不改变 p-p38 的基础水平。这是由于 p38 的自身磷酸化,是不受 SB203580 影响的。
 
  SB203580 通过降低下游 MAPKAPK2,HSP27 和 ATF2 磷酸化来调节 p38 MAPK 信号通路。SB203580 通过结合 ATP 结合区来抑制 p38 MAPK 的催化活性,但不能抑制上游激酶对 p38 MAPK 的磷酸化。
 
  
  图 4. SB203580 作用机制
 
  So,找到了原因咱再来一次就离成功不远啦!阳光耀眼,乐观地,向前走!
 
  除了以上建议外,萌 Cece 还有一些超实用法宝:
 
  1、在裂解液中加入足量的蛋白酶抑制剂 
 
  2、检测磷酸化蛋白时,加入磷酸酶抑制剂 
 
  3、建议使用 RIPA 裂解液 (强) 
 
  4、转膜结束后,使用丽春红染色确认转膜效果。
 
  5、选用高灵敏度的 ECL 发光液, 特超敏 ECL 化学发光试剂盒 

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