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Y-27632是rock抑制剂

  Y-27632 是一种ATP竞争性的 ROCK-I 和 ROCK-II 抑制剂,Ki 分别为 220 nM 和 300 nM。

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  Y-27632的生物活性

  体外

  Y-27632抑制ROCK家族的激酶比其他激酶(包括蛋白激酶C,cAMP依赖性激酶和肌球蛋白轻链激酶)强100倍。 Y-27632延长滞后时间并以浓度依赖性方式延迟BrdU标记细胞的出现,在分别用10和100μMY-27632处理的Swiss 3T3细胞中观察到约1和4小时的延迟。 Y-27632促进脂肪组织来源的干细胞(ADSCs)的神经元分化。 与1.0和2.5μMY-27632诱导组相比,神经样细胞的百分比在5.0μMY-27632诱导组中达到峰值。

  体内

  与盐水组相比,Y-27632(5和10 mg / kg)显着延长肌阵挛性抽搐的起效时间。 与生理盐水组相比,Y-27632(5和10 mg / kg)显着延长阵挛性惊厥的发作时间。 与对照动物(S-S组)相比,用二甲基亚硝胺(DMN)处理导致大鼠体重和肝脏重量(DMN-S组)显着降低。 口服Y27632(30 mg / kg)基本上可以预防这种DMN诱导的大鼠体重和肝脏重量减轻(DMN-Y组)

  Y-27632的实验参考方法

  激酶测定

  通过使用Lipofectamine转染,重组ROCK-1,ROCK-II,PKN或citron激酶在HeLa细胞中表达为Myc标记的蛋白,并通过使用与G蛋白偶联的9E10单克隆抗Myc抗体从细胞裂解物中沉淀。 - 琼脂糖。 回收的免疫复合物与不同浓度的[32P] ATP和10mg组蛋白2型作为底物在不存在或存在各种浓度的Y-27632或Y-30141的条件下于30℃温育30分钟,总体积为 30μL含有50mM HEPES-NaOH,pH 7.4,10mM MgCl 2,5mM MnCl 2,0.02%Briji 35和2mM二硫苏糖醇的激酶缓冲液。 将PKCa与5μM[32P] ATP和200μg/ mL组蛋白2型作为底物孵育,在不存在或存在各种浓度的Y-27632或Y-30141的情况下,在含有50μL的激酶缓冲液中于30°C保持10分钟 mM Tris-HCl,pH 7.5,0.5mM CaCl 2,5mM乙酸镁,25μg/ mL磷脂酰丝氨酸,50ng / mL 12-O-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯和0.001%亮抑酶肽,总体积为30μL。 通过添加10μL的43 Laemmli样品缓冲液终止孵育。 煮沸5分钟后,将混合物在16%凝胶上进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 用考马斯亮蓝染色凝胶,然后干燥。 切除对应于组蛋白2型的条带,并测量放射性。

  MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。

  细胞分析

  HeLa细胞以每3.5cm培养皿3×104个细胞的密度接种。 在10mM胸苷存在下,将细胞在含有10%FBS的DMEM中培养16小时。 用含有10%FBS的DMEM洗涤细胞后,再培养8小时,然后加入40ng / mL的诺考达唑。 在Nocodazole处理11.5小时后,加入各种浓度的Y-27632(0-300μM),Y-30141或载体,并将细胞再孵育30分钟。

  MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。

  Animal Administration

  小鼠

  使用重25-30g的雄性近交瑞士白化小鼠(2-3个月大)。 每周给小鼠注射亚痉挛剂量的PTZ(35mg / kg,i.p。)(周一,周三和周五),总共注射11次。 在每次PTZ注射后,观察小鼠30分钟并记录惊厥活动的发生。 30分钟后,然后给小鼠注射法舒地尔(25mg / kg,腹膜内注射)或Y-27632(5mg / kg,腹膜内注射)并返回其家笼,直至下一次注射。 用于法舒地尔和Y-27632的对照小鼠接受盐水。

  大鼠

  雄性Wistar种A使用大鼠(200-250g)。 将DMN(1μg/ mL)用盐水(终浓度1%)稀释10倍,并且在每周的前3天腹膜内(i.p.)注射10mg / kg每天的DMN,持续4周。 从第一次注射DMN开始,每天以30mg / kg的剂量口服给予Y27632,持续4周。 30mg / kg的剂量在几种大鼠模型中校正高血压而没有毒性。 将20只大鼠随机分成4个实验组(每组n = 5),如下:(1)S-S(腹腔注射生理盐水和口服盐水); (2)S-Y(腹腔注射生理盐水和口服Y27632); (3)DMN-S(DMN i.p.和口服盐水); (4)DMN-Y(DMN i.p.和口服Y27632)。 每周称重大鼠。 在第四周结束时将它们处死并切除肝脏。 另外,在处死大鼠之前立即采集血样。

  MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。

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