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XL388是mTOR抑制剂

    XL388 是一种高效的 ATP 竞争性 mTOR 抑制剂,IC50 为 9.9 nM。XL388 同时抑制 mTORC1 和 mTORC2。
 
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    生物活性
 
    体外
 
    XL388(化合物28)也抑制DNA-PK,IC50为8.831μM。XL388抑制mTOR复合物1(p-p70S6K,pS6和p-4E-BP1)和mTOR复合物2(pAKT(S473))底物的细胞磷酸化。XL388以ATP竞争方式起作用,随着ATP浓度的增加,IC 50值呈线性增加[XL388在促进MG-63细胞凋亡中显示出剂量依赖性效应。XL388(100 nM)在其他两种OS细胞系(U2OS和SaOs-2)中诱导细胞凋亡,但在非癌MC3T3-E1细胞中不诱导细胞凋亡。XL388有效抑制MG-63细胞中mTORC1和mTORC2的活化。XL388对mTORC1 / 2活化的作用也是剂量依赖性的。此外,在XL388(100 nM)处理的U2OS细胞,SaOs-2细胞和原代人类OS细胞中,mTORC1 / 2活化几乎被阻断
 
    体内
 
    为了评估XL388(化合物28)对mTOR途径信号传导的药效学作用,携带PC-3前列腺肿瘤的无胸腺裸鼠以100mg / kg XL388口服给药。雷帕霉素也以5mg / kg腹膜内给药作为参考。对于XL388,在1,4,8,16,24和32小时收集血浆和肿瘤样品,在给药后4小时收集雷帕霉素,并用缓冲液匀浆。然后合并每只动物的肿瘤裂解物(n = 5),并通过免疫印迹分析磷酸化的p70S6K,S6,4E-BP1和AKT的水平。XL388具有适度的终末消除半衰期(t 1/2 = 1.35 h,0.45 h,6.11 h和0.86 h,用于小鼠(10 mg / kg,iv),大鼠(3 mg / kg,iv),狗(3 mg) / kg,iv),猴子(3mg / kg,iv))[1]。
 
    实验参考方法
 
    激酶测定
 
    在4E-BP1蛋白的磷酸化后,以ELISA形式进行mTOR酶活性的测量。所有实验均以384孔格式进行。通常,将0.5μL含有不同浓度的测试化合物的DMSO与15μL酶溶液混合。加入15μL含有底物的溶液引发激酶反应。测定条件如下:在20mM Hepes,pH 7.2,1mM DTT,50mM NaCl,10mM MnCl 2中的 0.2nM mTOR,10μMATP和50nM NHis标记的4E-BP1。,0.02mg / mL BSA,0.01%CHAPS,50mMβ-甘油磷酸盐。在环境温度下孵育120分钟后,将20μL反应混合物转移到涂有Ni-螯合物的384孔板中。4E-BP1蛋白的结合步骤进行60分钟,然后用50μLTris缓冲盐水溶液(TBS)各洗涤4次。加入5%BSA-TBST(TBS中0.2%Tween-20)中的抗磷酸-4E-BP1兔免疫球蛋白G(IgG;20μL,1:5000),并将反应混合物进一步温育60分钟。在洗去一抗(四次50μL洗涤)后,类似地进行与二级辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗-IgG的孵育。在用TBST进行最后的洗涤步骤后,加入20μL的SuperSignal ELISA Femto,并使用EnVision读板仪测量发光
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
 
    细胞分析
 
    维持和培养U2OS,SaOs-2和MG-63 OS细胞系以及鼠颅骨衍生的成骨细胞MC3T3-E1细胞。培养OB-6人成骨细胞。对于鼠成骨细胞的原代培养,用0.1%胶原酶I和0.25%分散酶消化新生小鼠的修剪的颅盖。用完全培养基中和分离的细胞悬浮液并过滤。然后将颅骨成骨细胞重悬于含有15%FBS的10mLα-MEM中,并进行培养。细胞(5×10 4将(孔)悬浮于1mL含有1%琼脂,10%FBS和指示的XL388(5,25,100和200nM)处理的DMEM中。然后将细胞悬浮液加入100mm培养皿中预先固化的1%琼脂上。含药物的培养基每2天更新一次。孵育10天后,剩余菌落的数量被染色并手动计数
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
 
    Animal Administration
 
    小鼠,大鼠,狗和猴
 
    在雌性无胸腺裸鼠,雌性CD大鼠,雄性比格犬和雄性食蟹猴中测定XL388的药代动力学研究。XL388静脉内给药,口服管饲10mg / kg,以EPW(5%乙醇/ 45%PEG400 /水+ 1:2HCl(m / m))配制成小鼠,3mg / kg作为溶液。用EPW(5%乙醇/ 45%PEG400 /水+ 1:2HCl(m / m))配制成CD大鼠和雄性比格犬,3mg / kg作为EPW配制的溶液(5%乙醇/ 45%)雄性食蟹猴的PEG400 /水+ 1:1.5HCl(m / m))。在24小时内监测XL388的血浆水平。
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

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