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USP7-IN-1

    USP7-IN-1是一种选择性的,可逆的泛素蛋白特异性蛋白酶 (USP7) 抑制剂,IC50 值为 77 μM,可用于癌症研究。
 
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    生物活性
 
    体外
 
    USP7-IN-1(实施例2)是USP7的选择性和可逆抑制剂,IC 50为77μM,并且对USP8,USP5,Uch-L1,Uch-L3或胱天蛋白酶3没有抑制作用.USP7-IN- 1抑制HCT116细胞的增殖,GI 50为67μM。
 
    实验参考方法
 
    激酶测定
 
    USP7在USP缓冲液(50mM Tris HCl; 0.5mM EDTA(乙二胺四乙酸); 5mM DTT; 0.01%Triton X-100;牛血清白蛋白0.05mg / mL pH7.6)中稀释。将化合物原液(10mM)在-20℃下储存在DMSO中。在不同浓度下测试化合物(包括USP7-IN-1):从200μM至91nM。反应在Black 384孔板中重复进行(10μL最终反应体积)。USP7的底物浓度为300nM Ub-AMC。特异性测定中酶(USP7)的浓度为100pM。确定浓度以在固定底物浓度下在初始速度下进行特异性测定。将化合物与酶在25℃下预孵育30分钟。通过向含有在测定缓冲液中稀释的酶(+/-化合物)的平板中加入底物来引发反应。将反应在37℃下温育60分钟。加入乙酸(终浓度100mM)终止反应。读数在Pherastar荧光读数器上进行。λ发射380 nm; λ激发= 460nm。将数据(平均值+/-标准偏差)分析为对照的%(无化合物),并使用GraphPad绘制为相对于化合物浓度的Log的百分比。数据拟合为S形模型(可变斜率).
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
 
    细胞分析
 
    将HCT116结肠癌细胞维持在含有10%FBS,3mM谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的Mc Coy 5A培养基中。将细胞在37℃下在含有5%CO 2的潮湿气氛中温育。使用MTS技术在96孔培养板中测定细胞活力。MTS(3-(4,5-二甲基 - 噻唑-2-基)-5-(3-羧基 - 甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓)是MTT衍生的四唑鎓,是将代谢活跃的细胞减少为可溶的,细胞渗透性的甲。通过其在492nm处的吸光度检测的甲amount的量与活的,代谢活性的细胞的数量成比例。10 3每孔接种HCT116细胞。24小时后,更换培养基并将细胞一式三份处理,每种化合物的浓度为100μM至50nM。将化合物(包括USP7-IN-1)在100%DMSO中稀释,其在细胞上的最终浓度保持在0.5%。将细胞与化合物一起温育72小时,然后通过加入MTS测定其存活力2小时。直接从96孔培养板测量492nm处的吸光度。使用S形可变斜率拟合计算每种化合物的GI 50(生长抑制50)浓度。数值代表三次独立实验的平均值。
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

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