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Neratinib(HKI-272)

    Neratinib是一种可口服的,不可逆的 tyrosine kinase 抑制剂,能够抑制 HER2 和 EGFR 的活性,IC50 值分别为 59 nM 和 92 nM。
 
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    生物活性
 
    体外
 
    Neratinib对酪氨酸激酶KDR和Src具有抑制作用,IC 50分别为0.8μM和1.4μM ,与HER2相比,活性降低14倍和24倍。Neratinib对其他丝氨酸 - 苏氨酸激酶没有活性,如Akt,细胞周期蛋白D1 / cdk4,细胞周期蛋白E / cdk2,细胞周期蛋白B1 / cdk1,IKK-2,MK-2,PDK1,c-Raf和Tpl-2,以及作为酪氨酸激酶c-Met。Neratinib选择性抑制转染HER2(3T3 / neu)的3T3细胞以及其他两种HER-2过表达SK-Br-3和BT474细胞的增殖,IC 50值为2-3 nM,显示> 230-与未转染的3T3细胞以及EGFR-和HER2-阴性的MDA-MB-435和SW620相比,倍数效力。Neratinib还用IC 50抑制EGFR依赖性A431细胞的增殖81 nM。Neratinib降低BT474细胞中HER2受体的自身磷酸化,IC 50为5 nM,而A431细胞中EGFR的EGF依赖性磷酸化,IC 50为3 nM。Neratinib阻断HER-2导致下游MAPK和Akt途径的抑制,IC 50为2 nM,比曲妥珠单抗更有效。Neratinib抑制BT474细胞中细胞周期蛋白D1的表达和Rb易感基因的磷酸化,IC 50为9 nM,导致G1-S停滞并最终导致细胞增殖减少。
 
    体内
 
    口服治疗的neratinib显着抑制3T3 / neu异种移植物的生长,分别在10,20,40和80mg / kg /天的剂量下抑制34%,53%,98%和98%。与在40mg / kg /天给药1小时内HER-2磷酸化抑制84%相一致,Neratinib在5,10的剂量下抑制BT-744异种移植物的生长70-82%,67%和93% ,和40毫克/千克/天。Neratinib对SK-OV-3异种移植物也有效,在5和60mg / kg /天时分别抑制31%和85%。与HER-2依赖性肿瘤相比,Neratinib对EGFR依赖性A431异种移植物的效力较低,分别在5和20mg / kg /天时具有32%和44%的抑制。Neratinib对表达低水平HER-2和EGFR的MCF-7和MX-1异种移植物几乎没有活性,在80 mg / kg /天时仅有28%的抑制作用
 
    实验参考方法
 
    激酶测定
 
    将Neratinib制备成DMSO中的10mg / mL储液,并在25mM HEPES(pH7.5; 0.002ng / mL-20μg/ mL)中稀释。将纯化的HER2重组COOH-末端片段(氨基酸676-1255)或表皮生长因子受体(EGFR)(氨基酸645-1186)[在100mM HEPES(pH7.5)和50%甘油中稀释]以增加的浓度温育的来那替尼在4mM的HEPES(pH 7.5)中,0.4mM的的MnCl 2,20μM钒酸钠和0.2mM DTT,在室温下15分钟在96孔ELISA板。通过添加40μMATP和20mM MgCl 2引发激酶反应 并允许在室温下进行1小时。洗涤平板,并使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体(15ng /孔)检测磷酸化。在洗涤和增强步骤后,使用Victor2荧光读数器(激发波长340nm,发射波长615nm)检测信号。从抑制曲线计算抑制50%受体磷酸化的Neratinib浓度(IC 50)。
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
 
    细胞分析
 
    将细胞暴露于各种浓度的Neratinib 2或6天。使用磺酰罗丹明B(一种蛋白质结合染料)测定细胞增殖。简言之,将细胞用10%三氯乙酸固定并用水充分洗涤。然后将细胞用0.1%磺酰罗丹明B染色并在5%乙酸中洗涤。将蛋白质相关染料溶解于10mM Tris中,并在450nM下测量吸光度。从抑制曲线确定抑制50%细胞增殖的Neratinib浓度(IC 50)
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
 
    Animal Administration
 
    将肿瘤细胞(维持在组织培养物中)或肿瘤片段皮下植入雌性无胸腺(裸)小鼠的侧腹。对于雌激素依赖性细胞系(BT474,MCF-7和SK-OV-3),在植入肿瘤前1周,给动物植入激素颗粒(0.72mg 17-β雌二醇,60天释放)。另外,将SK-OV-3细胞悬浮在Matrigel基底膜基质中用于植入。在将动物随机分配到不同治疗组(分期,第0天)后,在肿瘤达到90-200mg的大小后开始治疗。对于3T3 / neu异种移植物,在肿瘤植入后第二天(第0天)开始治疗。HKI-272在0.5%甲基纤维素-0.4%聚山梨醇酯-80(吐温80)中配制,并通过管饲法每日口服施用。肿瘤质量[(长×宽2))/ 2]每7天确定一次。除3T3 / neu外,所有异种移植研究中的肿瘤生长表示为相对肿瘤生长:第0天平均肿瘤质量与平均肿瘤质量的比率。相对于载体处理的对照计算肿瘤生长的抑制。在数据的对数转换后使用单尾学生t检验(等方差)证明抑制的统计显着性。
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

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