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PLX-4720(PLX4720)

    PLX-4720 是一种有效的,选择性的 B-RafV600E 抑制剂,IC50 值为 13 nM;与对 c-Raf-1 的选择性相同,是野生型 B-Raf 选择性的 10 倍。
 
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    PLX-4720的生物活性
 
    体外
 
    PLX-4720对野生型B-Raf的选择性> 10倍,对其他激酶如Frk,Src,Fak,FGFR和Aurora A的选择性> 100倍,IC 50为1.3-3.4μM。PLX-4720显着抑制携带B-Raf V600E的细胞系中的ERK磷酸化,IC 50为14-46nM,而不是具有野生型B-Raf的细胞。PLX-4720显着抑制携带B-Raf V600E致癌基因的肿瘤细胞系的生长,例如COLO205,A375,WM2664和COLO829,GI 50分别为0.31μM ,0.50μM,1.5μM和1.7μM 。此外,1μM的PLX-4720处理仅在B-Raf V600E中诱导细胞周期停滞和细胞凋亡阳性的1205Lu细胞,但不在B-Raf野生型C8161细胞中。与PTEN 细胞系相比,PLX-4720处理(10μM)显着诱导PTEN +细胞中BIM的> 14倍表达(4倍),解释了PTEN 细胞对PLX-4720的抗性。 - 诱导细胞凋亡。
 
    在体内
 
    以20mg / kg /天口服施用PLX-4720诱导显着的肿瘤生长延迟和B-Raf V600E依赖性COLO205肿瘤异种移植物中的消退,即使在1g / kg的剂量下也没有明显的小鼠副作用。每天两次100mg / kg的PLX-4720几乎完全消除了带有B-Raf V600E的1205Lu异种移植物,而对携带野生型B-Raf的C8161异种移植物没有活性。PLX-4720的抗肿瘤作用与那些携带V600E突变的细胞中MAPK通路的阻断相关。PLX-4720以30mg / kg /天的剂量显着抑制8505c异种移植物的肿瘤生长> 90%,并显着降低远处肺转移。
 
    PLX-4720的实验参考方法
 
    激酶测定
 
    对于每种酶(0.1 ng),在20 mM Hepes(pH 7.0),10 mM MgCl 2中进行20-μL反应,1mM DTT,0.01%吐温-20,100nM生物素-MEK蛋白,各种ATP浓度,以及室温下增加浓度的PLX-4720。用5μL含有20mM Hepes(pH 7.0),200mM NaCl,80mM EDTA和0.3%BSA的溶液在2,5,8,10,20和30分钟停止反应。终止溶液还包括来自AlphaScreen蛋白A检测试剂盒的磷酸-MEK抗体,链霉抗生物素蛋白包被的供体珠和蛋白A受体珠。将抗体和珠子在室温下在黑暗中在终止溶液中预孵育30分钟。抗体的最终稀释度为1 / 2,000,每个珠子的最终浓度为10μg/ mL。将测定板在室温下温育1小时,然后在PerkinElmer AlphaQuest读数器上读数。
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
 
    细胞分析
 
    用各种浓度的PLX-4720处理细胞24,48和72小时。通过使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定或MTT测定来测量细胞增殖。对于细胞周期分析,收集上清液和细胞,沉淀并用70%乙醇固定。在用碘化丙锭(10μg/ mL)染色之前,将细胞在37℃下在0.5mg / mL RNase I中温育1小时,以除去残留RNA污染的样品。然后使用EPICS XL装置分析样品。为了评估细胞凋亡,在用膜联蛋白-FITC和碘化丙锭染色之前收获培养基和细胞并沉淀。随后使用EPICS XL装置分析样品。
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
 
    Animal Administration
 
    将转移性黑素瘤细胞(2×10 6)皮下注射到SCID小鼠的侧腹中,并允许2周达到0.125mm 3体积。随后,动物每天两次接受100mg / kg PLX4720(口服强饲法)或载体对照,持续15天。每72小时记录肿瘤体积。将每个相应组的平均肿瘤大小标准化为治疗第一天的肿瘤体积。处理15天后,杀死动物并切除肿瘤,用福尔马林固定,石蜡包埋,并通过免疫组织化学分析。
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

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