Entinostat抑制剂

    Entinostat选择性，可口服的 HDAC class I 抑制剂，抑制 HDAC1，HDAC2 和 HDAC3 的 IC50 分别为 243 nM，453 nM 和 248 nM。

 

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    Entinostat的生物活性

 

    体外

 

    恩替司他（MS-275）对HDAC1和HDAC2的结合亲和力分别为282 nM和156 nM 。已经在人白血病和淋巴瘤细胞（U937，HL-60，K562和Jurkat）以及与分化和凋亡相关的原代急性髓性白血病母细胞中检测了HDAC抑制剂恩替司他（MS-275）的作用。MS-275在每种细胞系中显示剂量依赖性效应。当以低浓度（例如，1μM）施用时，MS-275表现出有效的抗增殖活性，诱导p21CIP1 / WAF1介导的生长停滞和U937细胞中分化标志物（CD11b）的表达。Entinostat（MS-275）有效诱导细胞死亡，48小时内约70％的细胞引发细胞凋亡。

 

    在体内

 

    49mg / kg的恩替司他（MS-27-275）显示出针对KB-3-1,4-1St和St-4肿瘤系的显着抗肿瘤作用，并且对Capan-1肿瘤具有中等作用。24.5mg / kg和12.3mg / kg的恩替司他也显示出对这些肿瘤的显着作用。此外，口服恩替司他显着增加了给药后4-24小时HT-29肿瘤异种移植物中组蛋白乙酰化的水平。MS-275给予实验性自身免疫性神经炎（EAN）大鼠每天一次出现第一次神经系统症状，大大降低了EAN的严重程度和持续时间，减弱了巨噬细胞，T细胞和B细胞的局部积聚，以及脱髓鞘坐骨神经 此外，MS-275处理增加了渗入的Foxp3 +的比例EAN大鼠坐骨神经细胞和抗炎M2巨噬细胞。

 

    Entinostat的实验参考方法

 

    激酶测定

 

    通过Nanosyn在384孔微量培养板中以10μL的反应体积进行HDAC活性的生化测定。标准酶促反应含有5μL2×HDAC抑制剂（如Entinostat），4μL2.5×酶和1μL10×底物的分析缓冲液（100 mM HEPES，pH 7.5,25 mM KCl，0.1％BSA） ，0.01％Triton X-100,1％DMSO）。酶促测定中所有HDAC的最终浓度为0.5至5nM。在所有测定中使用1μMFAM -RHKK（Ac）-NH 2或FAM-RHKK（三氟乙酰基）-NH 2的最终底物浓度，发现低于每种酶的测定K m，app。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    细胞分析

 

    将SH-SY5Y细胞保持在正常培养条件下，在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中每周拆分两次。将细胞以2500个细胞/孔接种在黑色384孔板中，在20-μL体积的补充有10％FBS的DMEM / F-12培养基中，并使其粘附过夜。第二天，将HDAC抑制剂（例如，Entinostat）在100％DMSO中连续稀释，随后将该系列交叉稀释到培养基中。将在培养基中稀释的5μL化合物（例如，Entinostat）加入到细胞板的适当孔中，以提供指示的最终浓度的抑制剂（例如，Entinostat）和最终的0.1％DMSO。在定量细胞ATP水平之前，将处理过的细胞在正常组织培养条件下孵育6,24,48,72或96小时，如使用CellTiter-Glo试剂测量的。类似地，在与HDAC抑制剂（例如，Entinostat）孵育6小时后，吸出来自单独细胞板的培养基，用不含抑制剂的培养基洗涤细胞一次。将补充有10％FBS和0.1％DMSO（无抑制剂）的25μL培养基加回细胞，并在孵育24,48,72或96小时后使用CellTiter-Glo测定细胞ATP水平。使用具有0.1秒计数时间的Envision仪器在每个时间点测量发光.

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    Animal Administration

 

    小鼠

 

    A2780细胞（9×10 6）悬浮于PBS中，并皮下注射到裸鼠的侧腹中。对于其他肿瘤系，KB-3-1，HCT-15,4-1St，Calu-3，St-4，Capan-1和HT-29，肿瘤在开始体内抗肿瘤测试前传代数次，并且通过使用套管针将肿瘤块（直径2-3mm）皮下移植到裸鼠的侧腹。在确认肿瘤在体内生长（肿瘤大小，20-100mm 3）后，开始用药物治疗（每个实验组中有4或5只小鼠）。恩替司他每周口服给药一次，每周5天，持续4周。每周监测肿瘤长度和宽度两次，并计算肿瘤体积。

 

    大鼠

 

    将雄性Lewis大鼠（8-10周，170-200g）饲养在12小时光照/黑暗循环下，自由获取食物和水。对于治疗性治疗，EAN大鼠从第10天至第14天（6只大鼠/组）每天腹膜内注射MS-275（3.5mg / kg）。对于注射，将MS-275悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并将相同体积（1mL）的PBS给予对照大鼠。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。