Bosutinib是Src/Abl的双抑制剂
2019-05-31 
MCE小分子
Bosutinib (SKI-606)是一种新型的双重Src/Abl抑制剂，在无细胞试验中IC50分别为1.2 nM 和 1 nM
MCE 的所有产品仅用作科学研究，我们不为任何个人用途提供产品和服务
体外研究
Bosutinib作用于Src比非Src家族激酶选择性高，IC50为1.2 nM,且有效抑制Src依赖的细胞增殖，IC50为100 nM。Bosutinib 显著抑制Bcr-Abl阳性白血病细胞系KU812, K562, 和MEG-01 而不是 Molt-4, HL-60, Ramos, 和其他白血病细胞系的增殖，IC50分别为5 nM, 20 nM,和20 nM，比 STI-571更有效。与STI-571类似, Bosutinib 作用于Abl-MLV转化纤维，具有看增殖活性，IC50为 90 nM。Bosutinib浓度分别为50 nM, 10-25 nM, 和200 nM 时,切除CML细胞中的Bcr-Abl 和STAT5及纤维中表达的v-Abl酪氨酸磷酸化，导致Bcr-Abl下游信号Lyn/Hck 磷酸化受抑制。虽然不能抑制乳腺癌细胞增殖和存活，但是可明显降低乳腺癌细胞运动和入侵，IC50为250 nM,提高细胞间粘附和β-连环蛋白的膜定位
体内研究
Bosutinib每天按60 mg/kg剂量有效作用于携带Src-转化纤维移植瘤和HT29移植瘤的裸鼠，T/C值分别为18%和30%。Bosutinib口服给药小鼠5天，显著抑制K562 肿瘤生长，这种作用存在剂量依赖性，按100 mg/kg 剂量处理可根除大的肿瘤，按150 mg/kg剂量处理可除去肿瘤，且没有毒性。与作用于HT29 移植瘤的效果相比，Bosutinib按 75 mg/kg剂量作用于携带Colo205移植瘤的裸鼠，每天两次，可抑制肿瘤生长，提高剂量后不会有更高效果，但是 按50 mg/kg剂量处理则没有效果
实验参考方法
激酶实验：
Src和Abl激酶实验:
使用ELISA法测定Src激酶活性。Src(每次反应3单位), 反应buffer(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 0.5 mM Na3VO4)和cdc2底物肽，加入不同浓度Bosutinib，然后在30oC下温育10分钟。加入ATP，终浓度为 100 μM,开始反应，30oC下温育1小时，然后加入 EDTA终止反应。在DELFIA 固相基于铕的检测法格板上进行 Abl 激酶实验。2 μM生物素化的肽段结合到链霉亲和素包被的微量滴定板上，在溶于PBS的1 mg/mL 卵清蛋白中进行1.5小时。用PBS/0.1% Tween-80冲洗板1小时，随后用PBS 冲洗。激酶反应在30oC下进行1小时。Abl激酶(10单位)与50 mM Tris-HCl(pH 7.5),10 mM MgCl2, 80 μM EGTA, 100 μM ATP, 0.5 mM Na3VO4,1% DMSO,1 mM HEPES (pH 7.0),200 μg/mL 卵清蛋白及不同浓度 Bosutinib混合。加入EDTA反应终止，终浓度为50 mM。使用Eu标记的磷酸酪氨酸抗体和DELFIA增强液监测反应
细胞实验：
Cell lines: Abl-MLV,Rat 2,KU812,K562,和MEG-01
Concentrations: 溶于DMSO,终浓度为1 μM 左右
Incubation Time: 72小时
Method: 用不同浓度Bosutinib处理细胞72小时。在Sigmacote处理的超低结合96孔板上检测Abl-MLV转化纤维的Anchorage非依赖增殖，阻止剩余细胞粘附。使用MTS或 Cell-Glo测定细胞增殖。为了测定细胞周期或者细胞死亡，细胞准备在CycleTest和DNA试剂盒中，用于FACS分析，在荧光激活的细胞分选流式细胞仪中进行分析。
动物实验:
Animal Models: 注射K562细胞的雌性裸鼠
Formulation: 悬浮于0.5%甲基纤维素/0.4% Tween-80
Dosages: 150 mg/kg/day
Administration: 口服饲喂
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体外研究
Bosutinib作用于Src比非Src家族激酶选择性高，IC50为1.2 nM,且有效抑制Src依赖的细胞增殖，IC50为100 nM。Bosutinib 显著抑制Bcr-Abl阳性白血病细胞系KU812, K562, 和MEG-01 而不是 Molt-4, HL-60, Ramos, 和其他白血病细胞系的增殖，IC50分别为5 nM, 20 nM,和20 nM，比 STI-571更有效。与STI-571类似, Bosutinib 作用于Abl-MLV转化纤维，具有看增殖活性，IC50为 90 nM。Bosutinib浓度分别为50 nM, 10-25 nM, 和200 nM 时,切除CML细胞中的Bcr-Abl 和STAT5及纤维中表达的v-Abl酪氨酸磷酸化，导致Bcr-Abl下游信号Lyn/Hck 磷酸化受抑制。虽然不能抑制乳腺癌细胞增殖和存活，但是可明显降低乳腺癌细胞运动和入侵，IC50为250 nM,提高细胞间粘附和β-连环蛋白的膜定位
体内研究
Bosutinib每天按60 mg/kg剂量有效作用于携带Src-转化纤维移植瘤和HT29移植瘤的裸鼠，T/C值分别为18%和30%。Bosutinib口服给药小鼠5天，显著抑制K562 肿瘤生长，这种作用存在剂量依赖性，按100 mg/kg 剂量处理可根除大的肿瘤，按150 mg/kg剂量处理可除去肿瘤，且没有毒性。与作用于HT29 移植瘤的效果相比，Bosutinib按 75 mg/kg剂量作用于携带Colo205移植瘤的裸鼠，每天两次，可抑制肿瘤生长，提高剂量后不会有更高效果，但是 按50 mg/kg剂量处理则没有效果
实验参考方法
激酶实验：
Src和Abl激酶实验:
使用ELISA法测定Src激酶活性。Src(每次反应3单位), 反应buffer(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 0.5 mM Na3VO4)和cdc2底物肽，加入不同浓度Bosutinib，然后在30oC下温育10分钟。加入ATP，终浓度为 100 μM,开始反应，30oC下温育1小时，然后加入 EDTA终止反应。在DELFIA 固相基于铕的检测法格板上进行 Abl 激酶实验。2 μM生物素化的肽段结合到链霉亲和素包被的微量滴定板上，在溶于PBS的1 mg/mL 卵清蛋白中进行1.5小时。用PBS/0.1% Tween-80冲洗板1小时，随后用PBS 冲洗。激酶反应在30oC下进行1小时。Abl激酶(10单位)与50 mM Tris-HCl(pH 7.5),10 mM MgCl2, 80 μM EGTA, 100 μM ATP, 0.5 mM Na3VO4,1% DMSO,1 mM HEPES (pH 7.0),200 μg/mL 卵清蛋白及不同浓度 Bosutinib混合。加入EDTA反应终止，终浓度为50 mM。使用Eu标记的磷酸酪氨酸抗体和DELFIA增强液监测反应
细胞实验：
Cell lines: Abl-MLV,Rat 2,KU812,K562,和MEG-01
Concentrations: 溶于DMSO,终浓度为1 μM 左右
Incubation Time: 72小时
Method: 用不同浓度Bosutinib处理细胞72小时。在Sigmacote处理的超低结合96孔板上检测Abl-MLV转化纤维的Anchorage非依赖增殖，阻止剩余细胞粘附。使用MTS或 Cell-Glo测定细胞增殖。为了测定细胞周期或者细胞死亡，细胞准备在CycleTest和DNA试剂盒中，用于FACS分析，在荧光激活的细胞分选流式细胞仪中进行分析。
动物实验:
Animal Models: 注射K562细胞的雌性裸鼠
Formulation: 悬浮于0.5%甲基纤维素/0.4% Tween-80
Dosages: 150 mg/kg/day
Administration: 口服饲喂
