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Notch信号通路检测

  100 多年前,科学家 Thomas Hunt Morgan 从翅膀有 “notches” (即缺口) 的突变果蝇中鉴定出 Notch 基因,而后,这条进化上高度保守的信号通路逐渐被挖掘,这么保守又不失个性的信号通路,科研人,上套路! 图片
 
  近期,Cell 刊登了清华大学施一公课题组大作:Structural basis of γ-secretase inhibition and modulation by small molecule drugs,该文阐述了 γ-分泌酶结合三种小分子抑制剂 (GSI) 和一种调节剂 (GSM) 的冷冻电镜结构,并首次展现了 γ-分泌酶结合底物与药物的过程。
 
  提到大名鼎鼎的 γ-分泌酶,肯定有小伙伴抢答“它是淀粉样蛋白前体蛋白 (APP) 的切割酶,与阿尔茨海默症有关”,但是今天,我们要说的是 γ-分泌酶的另一重身份——Notch 通路激活的重要切割酶。
 
  Notch 信号通路是一条在进化中高度保守的,决定细胞命运的重要信号通路之一。
 
  别具一格的NOTCH
 
  大多经典的信号通路 (如 RTK 信号通路) 遵循“信号-受体-信号转导 (产生二次信使)-细胞核-转录”的信号级联放大模式,而 Notch 通路则不按照这个套路出牌:Notch 受体与邻近细胞的配体相互作用介导短时通讯,从细胞表面到细胞核基因组的信号是直接的,线性的,没有信号级联放大的过程。
 
  
 
  图 1. Notch 信号通路
 
  经典信号通路中,细胞膜上的受体就像信号接收器,接受外源信号,继而发生下游级联放大反应,其配体可源于细胞外基质。而 Notch 信号通路的激活至少需要两个细胞,发生细胞之间的直接“对接”,细胞 A 提供配体,细胞 B 提供受体,是一种独特的依赖蛋白酶切的信号传导模式。
 
  Notch 通路的著名“三剪”
 
  Notch 通路由四部分组成:Notch 受体 (Notch1/2/3/4),Notch 配体 (Delta-like ligands, DLL1/3/4;Jagged ligands, JAG1/2),CSL-DNA 结合蛋白下游靶基因 (Hes 家族,MYC 等)。以上 4 个因素,任何一个因素改变都会对 Notch 信号传递产生影响。
 
  Notch 的受体和配体都是膜蛋白,Notch 受体与配体结合后,经过酶切,把有转录调节活性的 Notch 蛋白片段 (NICD 或 ICN) 释放出来,再与转录因子 CSL 结合,调节下游基因表达。
 
  
 
  图 2. Notch 信号通路激活示意图[2][3]
 
  行走江湖,Notch 有著名“三剪”。
 
  一剪 Notch 现形:Notch 以无活性的单肽前体形式在内质网中合成,此时的未成熟蛋白包括 Notch 膜外受体部分,跨膜区域以及胞内结构域 NICD 三个部分。Notch 初始蛋白被合成之后,转运至细胞高尔基体内,被高尔基体网络中的 Furin 转化酶蛋白水解切割,经过第一次酶切 (S1 cleavage) 后形成异二聚体形式的成熟 Notch 受体并转运至细胞表面。
 
  二剪内外殊途:细胞膜上成熟 Notch 异二聚体的胞外结构域与其他细胞的配体结合,受体配体结合后发生构象变化,在 ADAM 金属蛋白酶 (ADAM10 或 ADAM17/TACE) 切割的作用下发生第二次酶切 (S2 cleavage),此刻受体膜外部分完全被切掉。(这难道就是传说中的“一剪没”?
 
  三剪“成就” Notch:第二次酶切后剩余的其他部分,被 γ-分泌酶进行关键性的最后一切 (S3 cleavage),形成可溶性 NICD 入核。
 
  NICD 进入细胞核后,与 CSL 等转录蛋白结合,将原本“协同抑制复合物”转换为“协同活化复合物”,进而与 DNA 形成多蛋白-DNA 复合体,激活下游相关基因的表达。
 
  Notch 信号通路机制就是这么简单,那么在实验中是怎样研究 Notch 通路的呢?
 
  Notch 通路的基础研究“小套路”
 
  不像其他通路 (如 RTK、MAPK 等),Notch 通路没有磷酸化之类的指标可以检测。在文献里面最直观的实验手段就是使用 siRNA、shRNA 特异性沉默 Notch 蛋白,或者使用小分子抑制剂,如 γ-分泌酶抑制剂 (GSI)。
 
  以 Li Yi 等人的 Notch 相关研究文献 (PMID: 31382985) 为例,作者团队通过不同实验方法验证了神经胶质瘤起始细胞 (GICs) 中完整的 Notch1-CXCR4-PI3K 信号通路,证明了 Notch1 通过调节趋化因子系统 CXCL12/CXCR4,促进胶质瘤起始细胞的侵袭、自我更新和生长。
 
  
 
  图 3. Li Yi 等人验证 Notch 与 CXCR4 相关通路的实验思路图
 
  ■ RNA 沉默 (siRNA 与 shRNA)
 
  该团队首先通过磁珠分选 (MACS) 的方法,富集 U87 和 U251 胶质瘤细胞的 CD133+ (肿瘤起始细胞标记物) 细胞。CD133+ 胶质瘤细胞球中表现出高的 Notch1 活性 (图 4a,橘红色荧光)。同时,免疫荧光结果显示,与 CD133+ 胶质瘤细胞球中,Notch1 阳性胶质瘤细胞占很大比例,CXCR4 阳性胶质瘤细胞仅占 CD133+ 胶质瘤细胞球团的一小部分。但是,这些 CXCR4 与 Notch1 荧光染色共定位于球体的周围 (图 4b 黄色荧光共定位)。
 
  
 
  图 4. a. CD133 和 Nestin 的免疫荧光染色确定 GICs 表型;b. GICs 肿瘤球中 Notch1 和 CXCR4 的共定位免疫荧光染色确定蛋白互作关系
 
  为进一步研究 Notch1 在 GICs 中发挥的作用,作者团队建立了稳定的 Notch1 敲降神经胶质瘤起始细胞系 (U87-GIC/U251-GIC shNotch1)。如图 5a 所示,shNotch1 细胞系中 Notch1 信号通路蛋白 (Notch1, Hes1) 低表达,CXCR4 表达显著下调。并且shNotch1 组中 Notch1 的下调可以显着抑制 GICs 的自我更新、侵袭和迁移,如图 5b-d。
 
  
 
  图 5. a. 建立稳定的 shNotch1 细胞系;b. 肿瘤球形成实验;c-d. 肿瘤细胞侵袭和迁移实验
 
  ■ 使用小分子抑制剂
 
  γ-分泌酶抑制剂是最早发现和最大的一类 Notch 通路靶向药物,能阻止 Notch 受体的第 3 次酶切,从而阻止 NICD 的释放。
 
  前面提到,Notch1 影响 GICs 的自我更新和生长,为进一步证明这一机制,作者团队使用了 γ-分泌酶抑制剂 MK0752 来抑制 Notch1 途径。MK0752 剂量依赖性降低了活化的 Notch1 (NICD) 的蛋白表达。同时在 U87/U251GICs 中,Notch1 通路被 shRNA 或 MK0752 下调,CXCR4 的表达以及 AKT 和 mTOR 的磷酸化水平也被显着抑制。
 
  
 
  图 6. 在 U87GICs 和 U251GICs 中验证 Notch1-CXCR4-AKT/mTOR 通路
 
  此外,Norihiko Saito 等人证明了 GICs 对 γ-分泌酶抑制剂敏感程度并不相同 (PMID: 24038660)。根据 GICs 对 γ-分泌酶抑制剂给药的反应分为 Responder 和 Non-Responder 组。Responder 组中,Notch1、Notch1 NICD 和 Notch1 下游相关蛋白 (包括 Hes1、Hes3 和 Hes5) 均高表达,在 Non-Responder 组中则不然。γ-分泌酶抑制剂 DAPT 以剂量依赖性方式抑制 NICD、Hes1、Hes3 和 Hes5 的表达,而 Notch1 的表达没有改变。同样都是神经胶质瘤起源细胞,但这两组细胞对 DAPT 的响应并不相同。
 
  
 
  图 7. DAPT 对不同细胞系的 Notch1 相关蛋白的影响[5]
 
  总结:
 
  1、Notch 信号通路是线性的信号通路。
 
  2、Notch 信号通路激活后的检测,通常是检测通路被激活后的 NICD 或者下游一些靶基因。
 
  3、针对 Notch 信号通路的抑制剂,最主要的一大类是 γ-分泌酶抑制剂,但是并不是所有的细胞系都对抑制剂高度敏感,要结合文献选择抑制剂。
 
  Notch 通路的相关抑制剂
 
  γ-分泌酶 (γ-secretase) 抑制剂 (GSI)
 
 
  具有口服活性的 γ-secretase 抑制剂,具有神经保护活性,并可用于自身免疫性和淋巴增生性疾病,退化性疾病和癌症的研究。
 
  YO-01027
 
  二肽类 γ-secretase 抑制剂,裂解 Notch 和 APPL 的 IC50 分别为 2.92 nM 和 2.64 nM。
 
  BMS 299897
 
  有效的 γ-分泌酶抑制剂,抑制 β-淀粉样前体蛋白裂解的选择性比 Notch 裂解更高。
 
  LY-411575
 
  γ-分泌酶抑制剂,能够抑制 Aβ40 蛋白的产生,同时抑制 Notch 分裂。
 
  靶向 Notch 转录复合体的抑制剂
 
  IMR-1
 
  Notch 抑制剂,阻止 Maml1 募集到染色质上的 Notch 三元复合体 (NTC),抑制 Notch 靶基因转录。
 
  IMR-1A
 
  Notch 抑制剂,IMR-1 的酸代谢物,相对于 IMR-1 的效力增加。
 
  CB-103
 
  靶向 NOTCH 转录复合体,具有抗肿瘤活性。
 
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