Notch信号通路检测

　　100 多年前，科学家 Thomas Hunt Morgan 从翅膀有 “notches” （即缺口） 的突变果蝇中鉴定出 Notch 基因，而后，这条进化上高度保守的信号通路逐渐被挖掘，这么保守又不失个性的信号通路，科研人，上套路！ 图片

 

　　近期，Cell 刊登了清华大学施一公课题组大作：Structural basis of γ-secretase inhibition and modulation by small molecule drugs，该文阐述了 γ-分泌酶结合三种小分子抑制剂 （GSI） 和一种调节剂 （GSM） 的冷冻电镜结构，并首次展现了 γ-分泌酶结合底物与药物的过程。

 

　　提到大名鼎鼎的 γ-分泌酶，肯定有小伙伴抢答“它是淀粉样蛋白前体蛋白 （APP） 的切割酶，与阿尔茨海默症有关”，但是今天，我们要说的是 γ-分泌酶的另一重身份——Notch 通路激活的重要切割酶。

 

　　Notch 信号通路是一条在进化中高度保守的，决定细胞命运的重要信号通路之一。

 

　　别具一格的NOTCH

 

　　大多经典的信号通路 （如 RTK 信号通路） 遵循“信号-受体-信号转导 （产生二次信使）-细胞核-转录”的信号级联放大模式，而 Notch 通路则不按照这个套路出牌：Notch 受体与邻近细胞的配体相互作用介导短时通讯，从细胞表面到细胞核基因组的信号是直接的，线性的，没有信号级联放大的过程。

 

　　

 

　　图 1. Notch 信号通路

 

　　经典信号通路中，细胞膜上的受体就像信号接收器，接受外源信号，继而发生下游级联放大反应，其配体可源于细胞外基质。而 Notch 信号通路的激活至少需要两个细胞，发生细胞之间的直接“对接”，细胞 A 提供配体，细胞 B 提供受体，是一种独特的依赖蛋白酶切的信号传导模式。

 

　　Notch 通路的著名“三剪”

 

　　Notch 通路由四部分组成：Notch 受体 （Notch1/2/3/4），Notch 配体 （Delta-like ligands, DLL1/3/4；Jagged ligands, JAG1/2），CSL-DNA 结合蛋白，下游靶基因 （Hes 家族，MYC 等）。以上 4 个因素，任何一个因素改变都会对 Notch 信号传递产生影响。

 

　　Notch 的受体和配体都是膜蛋白，Notch 受体与配体结合后，经过酶切，把有转录调节活性的 Notch 蛋白片段 （NICD 或 ICN） 释放出来，再与转录因子 CSL 结合，调节下游基因表达。

 

　　

 

　　图 2. Notch 信号通路激活示意图[2][3]

 

　　行走江湖，Notch 有著名“三剪”。

 

　　一剪 Notch 现形：Notch 以无活性的单肽前体形式在内质网中合成，此时的未成熟蛋白包括 Notch 膜外受体部分，跨膜区域以及胞内结构域 NICD 三个部分。Notch 初始蛋白被合成之后，转运至细胞高尔基体内，被高尔基体网络中的 Furin 转化酶蛋白水解切割，经过第一次酶切 （S1 cleavage） 后形成异二聚体形式的成熟 Notch 受体并转运至细胞表面。

 

　　二剪内外殊途：细胞膜上成熟 Notch 异二聚体的胞外结构域与其他细胞的配体结合，受体配体结合后发生构象变化，在 ADAM 金属蛋白酶 （ADAM10 或 ADAM17/TACE） 切割的作用下发生第二次酶切 （S2 cleavage），此刻受体膜外部分完全被切掉。（这难道就是传说中的“一剪没”？

 

　　三剪“成就” Notch：第二次酶切后剩余的其他部分，被 γ-分泌酶进行关键性的最后一切 （S3 cleavage），形成可溶性 NICD 入核。

 

　　NICD 进入细胞核后，与 CSL 等转录蛋白结合，将原本“协同抑制复合物”转换为“协同活化复合物”，进而与 DNA 形成多蛋白-DNA 复合体，激活下游相关基因的表达。

 

　　Notch 信号通路机制就是这么简单，那么在实验中是怎样研究 Notch 通路的呢？

 

　　Notch 通路的基础研究“小套路”

 

　　不像其他通路 （如 RTK、MAPK 等），Notch 通路没有磷酸化之类的指标可以检测。在文献里面最直观的实验手段就是使用 siRNA、shRNA 特异性沉默 Notch 蛋白，或者使用小分子抑制剂，如 γ-分泌酶抑制剂 （GSI）。

 

　　以 Li Yi 等人的 Notch 相关研究文献 （PMID: 31382985） 为例，作者团队通过不同实验方法验证了神经胶质瘤起始细胞 （GICs） 中完整的 Notch1-CXCR4-PI3K 信号通路，证明了 Notch1 通过调节趋化因子系统 CXCL12/CXCR4，促进胶质瘤起始细胞的侵袭、自我更新和生长。

 

　　

 

　　图 3. Li Yi 等人验证 Notch 与 CXCR4 相关通路的实验思路图

 

　　■ RNA 沉默 （siRNA 与 shRNA）

 

　　该团队首先通过磁珠分选 （MACS） 的方法，富集 U87 和 U251 胶质瘤细胞的 CD133+ （肿瘤起始细胞标记物） 细胞。CD133+ 胶质瘤细胞球中表现出高的 Notch1 活性 （图 4a，橘红色荧光）。同时，免疫荧光结果显示，与 CD133+ 胶质瘤细胞球中，Notch1 阳性胶质瘤细胞占很大比例，CXCR4 阳性胶质瘤细胞仅占 CD133+ 胶质瘤细胞球团的一小部分。但是，这些 CXCR4 与 Notch1 荧光染色共定位于球体的周围 （图 4b 黄色荧光共定位）。

 

　　

 

　　图 4. a. CD133 和 Nestin 的免疫荧光染色确定 GICs 表型；b. GICs 肿瘤球中 Notch1 和 CXCR4 的共定位免疫荧光染色确定蛋白互作关系

 

　　为进一步研究 Notch1 在 GICs 中发挥的作用，作者团队建立了稳定的 Notch1 敲降神经胶质瘤起始细胞系 （U87-GIC/U251-GIC shNotch1）。如图 5a 所示，shNotch1 细胞系中 Notch1 信号通路蛋白 （Notch1, Hes1） 低表达，CXCR4 表达显著下调。并且shNotch1 组中 Notch1 的下调可以显着抑制 GICs 的自我更新、侵袭和迁移，如图 5b-d。

 

　　

 

　　图 5. a. 建立稳定的 shNotch1 细胞系；b. 肿瘤球形成实验；c-d. 肿瘤细胞侵袭和迁移实验

 

　　■ 使用小分子抑制剂

 

　　γ-分泌酶抑制剂是最早发现和最大的一类 Notch 通路靶向药物，能阻止 Notch 受体的第 3 次酶切，从而阻止 NICD 的释放。

 

　　前面提到，Notch1 影响 GICs 的自我更新和生长，为进一步证明这一机制，作者团队使用了 γ-分泌酶抑制剂 MK0752 来抑制 Notch1 途径。MK0752 剂量依赖性降低了活化的 Notch1 （NICD） 的蛋白表达。同时在 U87/U251GICs 中，Notch1 通路被 shRNA 或 MK0752 下调，CXCR4 的表达以及 AKT 和 mTOR 的磷酸化水平也被显着抑制。

 

　　

 

　　图 6. 在 U87GICs 和 U251GICs 中验证 Notch1-CXCR4-AKT/mTOR 通路

 

　　此外，Norihiko Saito 等人证明了 GICs 对 γ-分泌酶抑制剂敏感程度并不相同 （PMID: 24038660）。根据 GICs 对 γ-分泌酶抑制剂给药的反应分为 Responder 和 Non-Responder 组。Responder 组中，Notch1、Notch1 NICD 和 Notch1 下游相关蛋白 （包括 Hes1、Hes3 和 Hes5） 均高表达，在 Non-Responder 组中则不然。γ-分泌酶抑制剂 DAPT 以剂量依赖性方式抑制 NICD、Hes1、Hes3 和 Hes5 的表达，而 Notch1 的表达没有改变。同样都是神经胶质瘤起源细胞，但这两组细胞对 DAPT 的响应并不相同。

 

　　

 

　　图 7. DAPT 对不同细胞系的 Notch1 相关蛋白的影响[5]

 

　　总结：

 

　　1、Notch 信号通路是线性的信号通路。

 

　　2、Notch 信号通路激活后的检测，通常是检测通路被激活后的 NICD 或者下游一些靶基因。

 

　　3、针对 Notch 信号通路的抑制剂，最主要的一大类是 γ-分泌酶抑制剂，但是并不是所有的细胞系都对抑制剂高度敏感，要结合文献选择抑制剂。

 

　　Notch 通路的相关抑制剂

 

　　γ-分泌酶 （γ-secretase） 抑制剂 （GSI）

 

　　DAPT

 

　　具有口服活性的 γ-secretase 抑制剂，具有神经保护活性，并可用于自身免疫性和淋巴增生性疾病，退化性疾病和癌症的研究。

 

　　YO-01027

 

　　二肽类 γ-secretase 抑制剂，裂解 Notch 和 APPL 的 IC50 分别为 2.92 nM 和 2.64 nM。

 

　　BMS 299897

 

　　有效的 γ-分泌酶抑制剂，抑制 β-淀粉样前体蛋白裂解的选择性比 Notch 裂解更高。

 

　　LY-411575

 

　　γ-分泌酶抑制剂，能够抑制 Aβ40 蛋白的产生，同时抑制 Notch 分裂。

 

　　靶向 Notch 转录复合体的抑制剂

 

　　IMR-1

 

　　Notch 抑制剂，阻止 Maml1 募集到染色质上的 Notch 三元复合体 （NTC），抑制 Notch 靶基因转录。

 

　　IMR-1A

 

　　Notch 抑制剂，IMR-1 的酸代谢物，相对于 IMR-1 的效力增加。

 

　　CB-103

 

　　靶向 NOTCH 转录复合体，具有抗肿瘤活性。

 

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