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Preladenant拮抗剂

    Preladenant是一种有效,竞争性的人腺苷 A2A 受体拮抗剂,Ki 为 1.1 nM,比其他腺苷受体选择性高100倍以上。
 
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    Preladenant的生物活性
 
    体外研究
 
    Preladenant还完全拮抗表达重组人A 2A受体的细胞中的cAMP 。确定Preladenant 在A 2A受体上的K B值为1.3 nM ; 该值与放射性配体结合试验中测定的K i值非常一致。使用表达A 2B受体的细胞的类似功能测定来证明对A 2B受体的选择性。在该测定中,Preladenant 的K B值为1.2μM,表明Preladenant对A 2A受体的选择性比A 2B受体高923倍。
 
    体内研究
 
    在每日重复给药后,Preladenant(1mg / kg)抑制L-多巴诱导的行为致敏,这表明运动障碍发展的风险降低。Preladenant在行为绝望模型中表现出抗抑郁样特征,即小鼠尾部悬吊试验和小鼠和大鼠强迫游泳试验。在1mg / kg(最低分数:9.0)和3mg / kg(最低分数:6.5)的剂量下,Preladenant产生剂量依赖性的帕金森病评分降低。亚阈值剂量的Preladenant将用3mg / kg L-多巴治疗的动物的最小和平均帕金森病评分分别降低至5.25和6.88。Wilcoxin测试用于比较个体治疗与媒介物。Preladenant(3 mg / kg),L-Dopa(3,6和12 mg / kg),以及Preladenant和L-Dopa(1或3 mg / kg + 3 mg / kg)的组合均显着改善帕金森病的最低分数。此外,相对于3 mg / kg L-Dopa组,12 mg / kg L-Dopa和L-Dopa + Preladenant组的最小和平均帕金森病评分均显着改善。
 
    Preladenant的实验参考方法
 
    激酶测定
 
    使用由具有腺苷受体重组表达的细胞制备的膜进行受体结合,如下:人A 2A和HEK 293,大鼠A 2A和中国仓鼠卵巢,人和大鼠A1和中国仓鼠卵巢,以及人A 3和HEK 293。放射性配体竞争结合测定在96孔板中以200μL的总测定体积进行,使用0.1至3μM的最终测试药物浓度范围。膜稀释在测定缓冲液,pH 7.4(A 1和A 2A,Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水,用10毫摩尔MgCl 2 ; A 3,的50mM Tris-HCL,120mM氯化钠,10毫摩尔MgCl 2)。为了从膜制剂中除去内源性腺苷,将4U / mL腺苷脱氨酶加入膜中,然后将其在室温下孵育15分钟。加入放射性配体至终浓度为0.5([ 3 H] SCH 58261,A 2A),1([ 3 H] DPCPX,A 1)或0.25([ 125 I] AB-MECA,A 3)nM。通过添加100nM CGS 15923(A 2A),100nM NECA(A 1)或100nM DPCPX(A 3)来定义非特异性结合。将板在室温下温育并搅拌1.5小时(A 2A和A 1)或2小时(A 3)。将膜过滤到Packard GF-B滤板上,并使用Brandel细胞收集器在冰冷的测定缓冲液中洗涤,以分离结合的和游离的放射性配体。将板干燥,然后向每个孔中加入45μLMicroscint20。通过使用迭代曲线拟合程序拟合位移曲线来确定IC 50值。使用Cheng-Prusoff方程计算K i值。
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
 
    细胞分析
 
    稳定表达人A 2A或A 2B受体的HEK 293细胞生长至汇合,使用无酶细胞解离缓冲液收获并通过离心沉淀(1000g; 5分钟)。洗涤细胞并在补充有10nM HPS,pH7.4,5mM MgCl 2和0.2%牛血清白蛋白的Hanks平衡盐溶液中稀释至最终密度为4×10 6个细胞/ mL 。将Preladenant在上述缓冲液中稀释,加入以下组分以达到各自的最终测定浓度:0.25%DMSO,2U / mL腺苷脱氨酶和100μMLo2017。细胞悬浮液(20μL)在50℃下预温育15分钟。在含有25μL载体或Preladenant的96孔板中的室温。CGS-21680(A 2A然后加入10倍所需浓度的5-N-环丙基甲酰氨基腺苷(A 2B),并将反应物在37℃温育15分钟。通过添加50μL测定/裂解缓冲液终止反应。绘制了在存在和不存在Preladenant的情况下CGS-21680的浓度响应曲线,并且通过使用GraphPad Prism软件[1]拟合曲线来确定EC 50值。
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
 
    Animal Administration
 
    小鼠和大鼠
 
    使用雄性CD大鼠和雄性CD1小鼠。将预聚物以50%聚乙二醇400口服给药,剂量体积为3至5mL / kg。在强迫游泳试验(FST)中,将小鼠单独放入用水(25℃)填充至10cm深度的玻璃圆筒中并放置6分钟。当鼠标以直立位置漂浮并且仅做小动作以使其头部保持在水上时,判断它是不动的。在6分钟测试期的最后4分钟期间,由对动物治疗无视的观察者记录不动的持续时间。在行为测试之前1小时给动物施用载体,Preladenant或SCH 412348。将每只大鼠单独放置在水柱(25℃)中并使其游泳15分钟,然后取出并在加热的外壳中干燥并返回其笼子。二十四小时后(测试日),将动物再次暴露于该条件下,并记录5分钟期间的总不动时间。另外,记录大鼠花在攀爬圆筒侧面的持续时间。在测试当天,在行为测试之前1小时给每只动物服用Preladenant,SCH 412348或载体。
 
    猴子使用
 
    六只雌性食蟹猴(Macaca fascicularis)猴子(体重3.5-4.2kg)。通过皮下(sc)施用MPTP(2-3mg / kg)每周一次使动物成为帕金森病,直至通过帕金森病残疾测量发生稳定的帕金森综合征(至少一个月的未改变的残疾评分为8或更高)。规模。在最后一次施用MPTP后至少2个月,用Prolopa(左旋多巴/苄丝肼,100 / 25mg)长期治疗猴子,直至形成清晰且可重复的运动障碍。在这些猴子中进行本发明的L-多巴和Preladenant(1mg / kg和3mg / kg,口服)的实验。
 
    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

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