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Lumacaftor是CFTR调节剂VX-809

  Lumacaftor(VX-809;VRT 826809)是CFTR调节剂,可纠正CFTR蛋白的折叠和运输。
 
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  Lumacaftor生物活性
 
  体外
 
  在费大鼠甲状腺(FRT)细胞,Lumacaftor提高了7.1±0.3倍(N=3)用载体处理的细胞相比(EC F508del-CFTR熟化50,0.1±0.1μM;N=3),并增强F508del-CFTR-由大约五倍介导氯离子转运(EC 50,0.5±0.1μM;N=3)。在Lumacaftor浓度大于10μM时,响应降低,导致钟形剂量响应关系与IC 50约为100μM。Lumacaftor在大鼠中具有口服生物利用度,并且体内血浆水平显着高于体外功效所需的浓度[1]。在两种细胞系中于37°C或27°C与细胞孵育后,Lumacaftor都会在HRP发光信号中产生浓度依赖性的增加,相似的EC 50值约为0.3µM。在F508-HRP CFBE41o-在37℃下细胞,Lumacaftor最大限度增加信号到大约250发光任意单位(AU)在大约60 AU的DMSO对照基线,表示大约4倍的信号增加。同样,与R1070W-HRP CFBE41o-在Lumanaftor细胞中,Lumacaftor在DMSO对照基线(约85 au)上将信号最大增加到约220 au,表示信号增加了约2.5倍。因此,两种细胞系均产生了具有良好动态范围的强信号,用于高通量筛选。
 
  体内
 
  在雄性Sprague-Dawley大鼠中口服1 mg/kg Lumacaftor导致C max为2.4±1.3μM,1/2时为7.7±0.4 h(平均值±SD;n=3),表明Lumacaftor口服可用于F508del-CFTR校正并具有超过EC 50 s的血浆水平。
 
  Lumacaftor实验参考方法
 
  激酶测定
 
  筛选是使用Beckman Coulter Biomek FX平台进行的。在一组试验中,R1070W-F508-CFTR-HRP(R1070W-HRP)-表达CFBE41o-细胞与含有25种μM受试化合物和0.5微克/毫升多西环素24小时在37℃下将100μL培养基。在第二组试验中,F508-CFTR-HRP(F508-HRP)-表达CFBE41o-将细胞与含有25µM测试化合物,2µM Lumacaftor和0.5µg/mL多西环素的100µL培养基在37°C下孵育24小时。所有复合板均包含阴性对照(DMSO)和阳性对照(2µM Lumacaftor)。在两种测定中,均用PBS洗涤细胞四次,并通过加入50µL/孔的HRP底物来测定HRP活性。摇动5分钟后,使用配备有自动堆叠器的Tecan Infinite M1000读板器测量化学发光(积分时间为100毫秒)。
 
  MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
 
  细胞分析
  铺板后,将表达F508-CFTR YFP的.A549细胞在37°C/5%CO 2下生长18-24小时。然后将细胞与100μL含测试化合物的培养基孵育18-24小时。在测定时,将细胞用PBS洗涤,然后与包含毛喉素(20μM)和染料木黄酮(50μM)的PBS一起温育10分钟。各孔单独地测定我-通过连续记录荧光(每点200毫秒)2秒钟(基线),然后快速加入165μLPBS的12秒后,其中137mM的氯涌入-由我取代-。最初的我-通过将数据的最后11.5秒与初始斜率外推的指数拟合来计算入流率,并针对扣除背景的初始荧光进行归一化。所有复合板均包含阴性对照(DMSO载体)和阳性对照(5µM Lumacaftor)。使用配备双注射泵(激发/发射500/535 nm)的Tecan Infinite M1000读板仪测量荧光。
 
  MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。
 
  动物实验
 
  大鼠
 
  雄性大鼠(每剂量组n=3)在5%/kg剂量体积的含0.5%Tween80/0.5%甲基纤维素/水的介质中口服Lumacaftor。血浆样品中Lumacaftor的浓度通过液相色谱/串联质谱法测定。使用WinNonlin Professional Edition软件计算药代动力学参数。
 
  MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

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